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液相色譜柱安裝與使用說明
更新時(shí)間:2012-12-25 瀏覽次數(shù):4313
液相色譜柱安裝與使用說明
液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成,其中液相色譜柱的正確安裝和使用,是液相色譜工作的關(guān)鍵;也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。
一、液相色譜柱的安裝:
1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu):
a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu),柱接頭是兩端螺紋組件,一端是為7/16英寸外螺紋,另一端是3/16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化)。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接,中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的內(nèi)螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接,中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積,在安裝色譜柱時(shí),用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底,然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在2.5mm長或其他固定尺寸)。
在兩端柱接頭內(nèi),柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或?yàn)V網(wǎng)),用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失??罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì),能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時(shí)要注意,柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑,以避免腐蝕。
b、柱填料:
液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進(jìn)行的,柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。
正相柱:多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種,其顆粒直徑在3—10 µm的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN,-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱:主要是以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等,其顆粒粒徑在3—10 µm之間。
2,色譜柱的安裝:
a、拆開柱包裝盒,確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。
b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
c、 按柱管上標(biāo)示的流動相流向,將色譜柱的入口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如條件允許,建議在柱前使用保護(hù)柱);柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底,然后順時(shí)針擰緊空心螺釘,直到擰不動為止,再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1/4-1/2圈,切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)象,請用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1/4圈,直至不漏液為止。
二、液相色譜柱的使用:
色譜柱在使用前,進(jìn)行柱的性能測試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外,在做柱性能測試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是*條件),只有這樣,測得的結(jié)果才有可比性。
1、樣品的前處理:
a、使用流動相溶解樣品。
b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45µm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動相的配制:
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,因此要求流動相具備以下的特點(diǎn):
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。
b、流動相具有一定惰性,與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
c、流動相的黏度要盡量小,以便在使用較長的分析柱時(shí)能得到好的分離效果;同時(shí)降低柱壓降,延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器,使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點(diǎn)不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
f、在流動相配制好后,一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動相流速的選擇:
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱,要追求*柱效,使用*流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。
當(dāng)選用*流速時(shí),分析時(shí)間可能延長??刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆?qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意:
1.由于甲醇廉價(jià),對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。
2.對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相,沒有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐),去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì),有可能影響分析結(jié)果。
3.含水流動相zui奸在實(shí)驗(yàn)前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。加入*,防止細(xì)菌生長。
4.流動相要求使用0.45 µm濾膜過濾,除去微粒雜質(zhì)。
5.使用HPLC級溶劑配制流動相,使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,提高柱性能。
4、柱性能測試:
——啟動液相色譜儀:a、流動相流速設(shè)定為1ml/min。
b、UV檢測器波長設(shè)定為254nm。
——使用出廠測試時(shí)使用的流動相組成及測試樣品。
——記錄并計(jì)算測試結(jié)果。
*參考(標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91)液相色譜儀測試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。
一、液相色譜柱的安裝:
1、液相色譜柱的結(jié)構(gòu):
a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu),柱接頭是兩端螺紋組件,一端是為7/16英寸外螺紋,另一端是3/16英寸的內(nèi)螺紋(國內(nèi)外已規(guī)范化)。7/16英寸外螺紋與1/4英寸柱管(Φ6.35mm)連接,中間放置壓壞用于密封。3/16英寸的內(nèi)螺紋與1/16英寸(Φ1.57mm)的連接管連接,中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積,在安裝色譜柱時(shí),用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底,然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環(huán)后露出的管長度應(yīng)嚴(yán)格控制在2.5mm長或其他固定尺寸)。
在兩端柱接頭內(nèi),柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或?yàn)V網(wǎng)),用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失??罩鹘M件均為316#不銹鋼材質(zhì),能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時(shí)要注意,柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑,以避免腐蝕。
b、柱填料:
液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進(jìn)行的,柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。
正相柱:多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種,其顆粒直徑在3—10 µm的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN,-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱:主要是以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等,其顆粒粒徑在3—10 µm之間。
2,色譜柱的安裝:
a、拆開柱包裝盒,確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。
b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
c、 按柱管上標(biāo)示的流動相流向,將色譜柱的入口端通過連接管與進(jìn)樣閥出口相連接(如條件允許,建議在柱前使用保護(hù)柱);柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底,然后順時(shí)針擰緊空心螺釘,直到擰不動為止,再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1/4-1/2圈,切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)象,請用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰1/4圈,直至不漏液為止。
二、液相色譜柱的使用:
色譜柱在使用前,進(jìn)行柱的性能測試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同;另外,在做柱性能測試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是*條件),只有這樣,測得的結(jié)果才有可比性。
1、樣品的前處理:
a、使用流動相溶解樣品。
b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。c、使用0.45µm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。
2、流動相的配制:
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,因此要求流動相具備以下的特點(diǎn):
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。
b、流動相具有一定惰性,與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
c、流動相的黏度要盡量小,以便在使用較長的分析柱時(shí)能得到好的分離效果;同時(shí)降低柱壓降,延長液體泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器,使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點(diǎn)不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。
f、在流動相配制好后,一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測,還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3、流動相流速的選擇:
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱,要追求*柱效,使用*流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。
當(dāng)選用*流速時(shí),分析時(shí)間可能延長??刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆?qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意:
1.由于甲醇廉價(jià),對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。
2.對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相,沒有提純的己烷不得使用。用水使用超純水(電阻率大于18兆歐),去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì),有可能影響分析結(jié)果。
3.含水流動相zui奸在實(shí)驗(yàn)前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。加入*,防止細(xì)菌生長。
4.流動相要求使用0.45 µm濾膜過濾,除去微粒雜質(zhì)。
5.使用HPLC級溶劑配制流動相,使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命,提高柱性能。
4、柱性能測試:
——啟動液相色譜儀:a、流動相流速設(shè)定為1ml/min。
b、UV檢測器波長設(shè)定為254nm。
——使用出廠測試時(shí)使用的流動相組成及測試樣品。
——記錄并計(jì)算測試結(jié)果。
*參考(標(biāo)準(zhǔn)JB5226-91)液相色譜儀測試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。
常見故障及排除 | | | |||
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| 柱壓升高 | 色譜柱入U(xiǎn)濾片被流動相或樣品中顆粒堵住。 樣品組分在濾片上沉淀堵住濾片。 | 卸下入口接頭的濾片,使用1:1的硝酸溶液超聲清洗5min,再用水、 甲醇清洗除去水份。 樣品及流動相使用0.45µm濾膜除去微量雜質(zhì)。 使用流動相作溶劑配制樣品。 | | |
| 新柱柱效低 | 柱外死體積大。 樣品在流動相中溶解不好,影響傳質(zhì)過程。 | 更換連接管,重新連接色譜柱,降低死體積。 使用合適的流動相或使用流動相溶解樣品。 | | |
| 舊色譜柱柱效低,分離不好,柱入口床層塌陷。 | 填料被流動相溶蝕而流失。 | 用同型填料填補(bǔ)柱效可部分恢復(fù)。 對硅膠質(zhì)填料,流動相PH值在2—7范圍內(nèi),否則可能被溶蝕。 | | |
| 舊色譜柱柱效低分離不好,有時(shí)出現(xiàn)雙峰。 | 入門填料被污染變質(zhì)所致。 | 用強(qiáng)溶劑沖洗。 刮除被污染的床層,用同型的填料填補(bǔ)柱效可部分恢復(fù)。 污染嚴(yán)重,則廢棄或重新填裝。 | | |
| 新柱接到儀器上后,柱頭漏液。 | 柱接頭與儀器之間連接管的壓環(huán)變形量不夠。 | 用扳手順時(shí)針方向擰緊1/4圈直到不漏液為止。 | | |
| 新柱接到儀器上后,啟動儀器沒有柱壓降。 | 柱放置時(shí)間過長柱內(nèi)充裝的液體己揮發(fā)干。 | 繼續(xù)開泵,用流動相將柱內(nèi)氣體置換掉。 | | |
| 新柱接到儀器上后,檢測器出口不斷有小氣泡出 現(xiàn)。 | ①同上。 ② 流動相脫氣不*特別是MeOH/H20體系由于氫鍵作用很容易出現(xiàn)氣泡。 | ①同上。 ②配好流動相后一定要進(jìn)行脫氣處理。 | | |
| 新柱接到儀器上后柱壓降不斷增加,甚至超過儀器的耐壓限。 | 柱入口濾片被固體顆粒堵塞(或被毒 菌堵塞)。 | 更換或清洗柱入口濾片;用0.45µm過濾膜過濾流動相除去微小顆粒物。 | | |
| 進(jìn)樣次數(shù)增加柱壓降逐漸增加。 | ①樣品中含有不溶于流動相的微小顆粒物。 ②樣品在流動相中析出微小結(jié)晶。 | ①用0.45µm過濾膜過濾樣品。 ②推薦使用流動相溶解樣品。 | | |
| 使用—段時(shí)間后,柱效下降,分離不好。 | ①柱填料被流動相溶解而流失。 ②柱填料被樣品雜質(zhì)污染。 | ①推薦使用予柱。如柱床層塌陷,用相同型號填料填補(bǔ)。 ②推薦使用保護(hù)柱或用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱除去污染雜質(zhì)。 | | |
| 柱使用一段時(shí)間后,柱效下降出現(xiàn)雙峰。 | 柱入口床層被污染使柱填料變質(zhì)。 | 用強(qiáng)溶劑沖洗除去雜質(zhì)。 | | |
| 柱使用—段時(shí)間后,柱效下降,出現(xiàn)峰拖尾。 | 柱入口床層被污染。 | 用強(qiáng)溶劑沖洗20-30ml,若效果不明顯應(yīng)廢棄。 | | |
| 進(jìn)樣量增大與峰面積增加不成正比.即進(jìn)樣量與峰面積不是線性關(guān)系。 | 樣品在流動相中的溶解度小,只有部分樣品被流動相沖如色譜柱中而另一部分則沉積在柱人口端。 | ①用流動相溶解樣品。 ②樣品的濃度不宜太大。 ④進(jìn)樣量不宜過大。 | | |
| 使用緩沖液作流動相時(shí),柱壓降升高很快。 | 霉菌生長所致。 | ①在流動相中加入有毒物質(zhì)或加疊氯化鈉防止霉菌生長。 ②實(shí)驗(yàn)結(jié)束后先用純水后用MeOH各沖洗20-30ml后關(guān)機(jī)。 | | |
| 用5µm顆粒填料柱時(shí), 以MeOH/H20作流動相柱壓較高。 | MeOH與水之間由于氫鍵作用黏度增大。 | 可用乙腈/水體系使柱壓降低,分離效率更好。 | | |
| 長時(shí)間放置的色譜柱,出現(xiàn)雙峰。 | 柱床層出現(xiàn)干裂。 | 柱放置時(shí),使用相應(yīng)的溶劑充填好,防止受大的機(jī)械震動,如床層干裂應(yīng)廢棄掉。 | | |
| 流動相洗滌強(qiáng)度由弱漸強(qiáng)時(shí)出現(xiàn)很多雜質(zhì)峰。 | 強(qiáng)溶劑將弱溶劑洗不出的雜質(zhì)沖出來。 | 不影響柱的性能。 | | |
| 柱使用一段時(shí)間后保留值逐漸縮短。 | 柱中固定相流失所致。 | ①更換色譜柱。 ②檢查所用的色譜條件是否合適。 | | |
| 在U V色譜圖中,靠近死時(shí)間處出現(xiàn)負(fù)峰。 | ①進(jìn)樣時(shí)壓力波動所致。 ②樣品溶劑比流動相的UV吸收值低。 | ①采用閥進(jìn)樣。 ②用流動相溶解樣品。 | |
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